ANÁLISIS DE LA MICROBIOTA ASOCIADA A DIARREAS NEONATALES PORCINA Y DE RUMIANTES MEDIANTE SECUENCIACIÓN MASIVA Y CARACTERIZACIÓN GENÓMICA DE LOS CLOSTRIDIOS IMPLICADOS (MIDICLO)

Título
MIDICLO- Análisis de la microbiota asociada a diarreas neonatales porcina y de rumiantes mediante secuenciación masiva y caracterización genómica de los clostridios implicados

Presupuesto 
157.300 € (Presupuesto total del proyecto);
130.000 € ITACYL 
Convocatoria 2019 Proyectos de I+D+i -RTI Tipo RTA Coord. Subárea: Ganadería y acuicultura. MCI/ AEI). PID2019-108071RR-C21. Asociado al proyecto se ha concedido la Ayuda para predoctorales para la formación de doctores. PRE2020-09060 .

Período
1 junio 2020- 30 noviembre 2023

Objetivos
Identificar las comunidades microbianas implicadas en la aparición de diarreas neonatales, así como caracterizar genómicamente a sus principales componentes, poniendo un especial énfasis en los géneros Clostridium y Clostridioides y otros géneros de gran incidencia en porcino y rumiantes como Escherichia. Determinando sus principales factores de virulencia, resistencia a antibióticos y capacidad toxigénica. Así como detectar posibles focos de contaminación, con el objetivo de promover medidas más eficaces de manejo de las explotaciones intensivas. Desde el ITACYL los esfuerzos se centran en el uso de tecnologías de secuenciación masiva, complementándolas con técnicas tradicionales de biología molecular y microbiología, para cumplir estos objetivos

Potencial impacto

• Descripción de los perfiles de composición bacteriana como marcadores de diarrea neonatal en ganado
• Implantación de nuevas estrategias basadas en secuenciación masiva para el control epidemiológico de diarreas neonatales
• Reducción del uso de determinados antibióticos en las explotaciones ganaderas, limitando la aparición de microorganismos multirresistentes
• Identificación de focos de contaminación reduciendo la exposición del ganado a dichos focos
• Disminución de las diarreas neonatales mediante la aplicación de tratamientos de limpieza y desinfección en las explotaciones 

Resultados
Se han establecido los principales perfiles bacterianos asociados a las disbiosis neonatales en bovino, caprino, porcino y ovino, mediante secuenciación metagenómica del ARNr 16S. Siendo los grupos de mayor incidencia para porcino Clostridium y Escherichia ocupando respectivamente un 15.06 % y un 11.17% de la comunidad bacteriana total, en bovino Escherichia con un 13.04 % y en caprino Escherichia y Bacteroides ocupando respectivamente un 51.77 % y un 19.95%.

En ovino se ha empleado como modelo de diarrea neonatal su principal afección, el síndrome de la boca mojada, lo que ha permitido determinar por primera vez el perfil bacteriano asociado al síndrome. Como grupos más abundantes Escherichia y Clostridium ocupando respectivamente un 36.72% y 28.52% de la comunidad bacteriana. También se ha descrito la distribución de las bacterias en el digestivo, siendo esta homogénea y como dicha composición varia a lo largo del tiempo, encontrando el momento de máxima alteración entre las 12-24h de vida del cordero.

Se han estudiado las características genotípicas de aislados asociados a diarreas neonatales, en concreto de 1212 aislados; 1066 en ovino, 38 en porcino y 108 en ovino. A partir de estos aislados se ha podido determinar los principales clostridios asociados a diarreas neonatales y en especial al síndrome de la boca mojada. Siendo estos C. perfringens (54.55%), C. bifermentans (25.45%), C. cadaveris (9.09%) y C. difficile (10.91) y las principales toxinas identificadas, Alpha, Kappa, Mu, Theta de C. perfringens y las toxinas A y B de C. difficile. También se ha identificado la capacidad de resistencia a antibióticos, concretamente a la doxiciclina, tetraciclina y minociclina para C. perfringens y en el caso de C. difficile a la estreptomicina, amikacina, butirosina, amikacina, butirosina, isepamicina, kanamicina, lividomicina, neomicina, paromomicina, ribostamicina, doxiciclina, tetraciclina y minociclina.

Finalmente se ha señalado la cama, el sistema de distribución de agua y la contaminación de calostros como los focos de contaminación más importantes a controlar ante diarreas neonatales. Además, se han establecido pruebas piloto para descontaminar la cama, empleando distintas estrategias, concretamente una solución basada en competencia bacteriana y la aplicación de amonios cuaternarios al 5% sobre la cama. Así como el uso de ácido peracético al 3% para descontaminar los sistemas de distribución de agua y la aplicación de enfriamiento rápido a los calostros post-pasteurización.

Conclusiones

• Las diarreas neonatales se encuentran asociadas a distintas desviaciones en la composición bacteriana normal, con altas proporciones de Clostridium y Escherichia aunque variable entre las especies de ganado estudiadas.
• La distribución de Clostridium y Escherichia es homogénea a lo largo del digestivo y presenta sus mayores densidades ente las 0-12h de vida en corderos con boca mojada.
• Los clostridios mayoritarios encontrados en individuos con diarreas neonatales son C. perfringens, C. bifermentans, C. cadaveris y C. difficile. Aunque se ha determinado C. perfringens y C. difficile como los principales agentes implicados por su capacidad diarreica y resistencia a antibióticos.
• Se ha determinado la cama, los sistemas de distribución de agua y el procesamiento del calostro como principales focos contaminantes y estudiado las medidas de control a implementar.
• El enfoque holístico de este estudio, determinando focos de contaminación, composición bacteriana, caracterización genómica de patógenos e implementación de medidas de control, pone en valor el uso de las tecnologías de secuenciación masiva en el control epidemiólogico de explotaciones intensivas.

Actividades de transferencia
identificación de microorganismos y puesta en marcha de medidas de control en granjas de Castilla y León. Difusión de la actividad a través de redes sociales. 

**Publicaciones en elaboración.